1.PCR引物設(shè)計(jì)：
　　
　　引物設(shè)計(jì)可能是PCR擴(kuò)增成功zui關(guān)鍵的因素。如引物設(shè)計(jì)欠佳，可能導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物不足，甚至擴(kuò)增失敗，其原因是設(shè)計(jì)欠佳的引物可導(dǎo)致非特異擴(kuò)增和/或形成引物二聚體，此又成為PCR反應(yīng)的競爭性產(chǎn)物，從而進(jìn)一步抑制PCR產(chǎn)物形成。
　　
　　在引物設(shè)計(jì)時必須考慮以下幾個因素，其中zui重要的是引物長度、溶解溫度(Tm)、特異性、引物序列互補(bǔ)問題、G/C含量和多嘧啶(T,C)或多嘌呤(A,G)延伸、3’-末端序列等。
　　
　　(1)引物長度：由于PCR反應(yīng)的特異性、退火溫度以及時間均至少部分與PCR引物長度相關(guān)聯(lián)，因此引物長度是PCR擴(kuò)增是否成功關(guān)鍵的因素。一般PCR引物長度為15-30核苷酸。
　　
　　(2)溶解溫度(Tm)：因加熱而斷開H鍵，使雙鏈DNA分開或“溶解”為單鏈DNA。溶解溫度(Tm)即指使一半雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA的溫度。Tm可采用下列公式計(jì)算：Tm＝2(A+T)+4(G+C)。
　　
　　需注意PCR反應(yīng)至少有兩個(一對)引物，兩個寡核苷酸引物Tm值應(yīng)比較接近，不可差異過大。因有較高的Tm值的引物在較低的反應(yīng)溫度時可發(fā)生錯配，而引物Tm值較低，反應(yīng)溫度較高時則可能不能發(fā)生作用，因此如引物的Tm值差異較大，可導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率低下甚至擴(kuò)增失敗。
　　
　　(3)引物序列互補(bǔ)：設(shè)計(jì)引物時應(yīng)沒有3個堿基以上的內(nèi)引物配對，如引物有這樣具有自我配對的區(qū)域，“彈回”即部分雙鏈結(jié)構(gòu)將發(fā)生在退火反應(yīng)時。
　　
　　(4)G/C含量和多嘧啶(T,C)或多嘌呤(A,G)延伸：待選擇的引物序列應(yīng)盡可能是堿基隨意分布，G+C含量平均-避免長A+T和富含G+C的區(qū)域。在引物的堿基組成中GC含量一般為45％-55％。在選擇的引物序列中應(yīng)沒有多G或多C延伸，因其可促進(jìn)非特異性退火，多A和多T延伸也應(yīng)避免，因其可“呼吸”和使引物－模板復(fù)合物展開延伸，降低擴(kuò)增的效率。同時多嘧啶(T,C)和多嘌呤(A,G)延伸也應(yīng)被避免。
　　
　　(5)3’-末端序列：為控制引物錯配，應(yīng)認(rèn)真地確定PCR引物中3’末端的位置。
　　
　　總而言之，應(yīng)重視PCR引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)PCR引物時應(yīng)認(rèn)真小心。對于一個成功的PCR來說，幾個重要因素如引物長度、GC含量和3’序列必須優(yōu)化。理想的引物應(yīng)為差不多隨意分布的核苷酸混合、GC含量50％、長度約為20個堿基，因此能使Tm值處于56-62ºC范圍。分析靶基因潛在引物位點(diǎn)時，應(yīng)考慮無單聚合體,沒有明顯的二級結(jié)構(gòu)形成的傾向，不自我互補(bǔ)，與其他雙鏈靶基因序列沒有明顯的同源性。為避免枯燥無味的設(shè)計(jì)，節(jié)省時間，減少錯誤，可應(yīng)用計(jì)算機(jī)程序優(yōu)化設(shè)計(jì)、選擇、確定寡核苷酸引物。